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清泻浊毒法对急性痛风性关节炎大鼠的抗炎作用及其机制探讨 ...

2016-8-6 13:06| 发布者: wangziyi| 查看: 283| 评论: 0|原作者: 姜萍|来自: [db:来源]

摘要: 急性痛风性关节炎是尿酸盐在关节及周围组织以结晶形式沉积引起的急性炎症反应。目前常用秋水仙碱、非甾体抗炎药及激素等治疗,有一定疗效,但副作用较大。周翠英教授经过数十年的经验总结,临床采用清泻浊毒法治疗, ...
       急性痛风性关节炎是尿酸盐在关节及周围组织以结晶形式沉积引起的急性炎症反应。目前常用秋水仙碱、非甾体抗炎药及激素等治疗,有一定疗效,但副作用较大。周翠英教授经过数十年的经验总结,临床采用清泻浊毒法治疗,取得很好效果。通过精简处方,反复筛选药物,拟定清泻浊毒方。本实验建立大鼠急性痛风性关节炎模型,观察其抗炎疗效及作用机制,以期进一步发掘高效低毒的防治药物。
材料
       1. 动物及分组 清洁级Wistar大鼠,雄性,体质量(200±22)g,共40只。山东大学医学院动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK(鲁)20090001。适应环境饲养1周后,将大鼠随机分为:空白组、模型组、清泻浊毒方组(清泻组)及吲哚美辛组(吲哚组),每组10只。
       2. 药品及试剂 吲哚美辛肠溶片(山西云鹤制药有限公司,批号:A090902)配制成浓度为50mg/100mL的混悬液。中药清泻浊毒方煎剂(金银花20g,蒲公英30g,土茯苓30g,熟大黄15g),煎煮浓缩成每毫升含生药1.71g的溶液,均4℃冷藏冰箱备用。尿酸钠(美国Sigma公司,批号:120K535)配制成5%的尿酸钠混悬液。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒(美国R&D公司,批号:BP-E69105R),白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)试剂盒(美国R&D公司,批号:BP-E61165R)。
       3. 仪器 雷杜RT6000酶标仪和雷杜RT3000洗板机(深圳雷杜科技生命有限公司),全自动生化分析仪(OLYMPUS AU2700),游标卡尺(上海良刃刀具厂)。
方法
       1. 造模及给药方法 空白组、模型组、清泻组及吲哚组每日分别灌胃0.9%氯化钠溶液及相应药物2mL,连续4d。参考徐权毅造模方法,用4号注射器将尿酸钠50μL刺入大鼠右侧踝关节背侧,从45°方向插入胫骨肌健内侧,注入踝关节腔。空白组注射无菌0.9%氯化钠溶液50μL。造模后继续给药3d。
       2. 观察项目及检测方法
       2.1 对关节肿胀度的影响 测量造模前、造模后24,72h各组大鼠右后足踝关节下0.5mm处的周长值。
       2.2 对关节组织IL-1β、TNF-α含量的影响 末次灌胃后1h,大鼠脱颈椎处死,参照文献[3-4]方法,在右踝关节上0.5cm处剪断,切开受试关节囊,用1mL0.9%氯化钠溶液灌洗关节腔,收集关节液,然后切取少量关节囊、滑膜等周围软组织,制成匀浆,与关节冲洗液一并3 000r/min,离心5min后取上清液,再用试剂盒分别测定IL-1β和TNF-α的含量。
       3. 关节组织病理改变 造模后72h,取关节软组织,10%福尔马林液固定48h,脱钙液脱钙,常规切片,HE染色,200倍光镜下观察受试关节及其周围软组织、滑膜上皮、炎症细胞浸润等情况。
       4. 统计学方法 所有数据均由SPSS 12.0统计软件包统计处理。各组数据以x-±s表示,均进行方差齐性检验后,采用方差分析,均值间两两比较用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
       1. 对急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀度的影响。造模前、造模后24h和72h各组间两两比较均无显著性差异;与造模前比较,模型组造模后、吲哚组造模后72h关节周径均增大(P<0.01)。清泻组造模后24h、72h分别与造模前比较均无显著性差异,说明清泻浊毒方对关节肿胀有良好的治疗作用,较吲哚美辛持久,但二者比较无统计学差异。
       2. 对急性痛风性关节炎大鼠关节组织IL-1β、TNF-α的影响。模型组IL-1β、TNF-α含量均较空白组有所升高(P<0.01),说明造模后关节局部炎性因子增多。经灌胃清泻浊毒方水煎剂和吲哚美辛后,两治疗组与模型组比较,IL-1β、TNF-α均有所下降(P<0.05,P<0.01),两治疗组之间无明显差异。
讨论
       周翠英教授认为急性痛风性关节炎的基本病机为脏腑积热蕴毒,毒邪内伏,卒感外邪,引动伏邪,内外相引,致热毒攻注经络骨节为患。以清泻浊毒为治法,方中金银花、蒲公英清解脏腑内毒;土茯苓、熟大黄清热利湿解毒,通利攻下,既可清内热,又可使浊毒从二便而解。
       急性痛风性关节炎发作期表现为关节红肿热痛,模型大鼠踝关节周径增大。本研究表明,清泻浊毒方能够明显改善急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀,控制局部炎症,与吲哚美辛作用相当,但较之持久。
       痛风性关节炎发病的主要环节为细胞因子介导的炎症反应。关节腔内的尿酸钠结晶引起中性粒细胞浸润、活化及一系列炎症因子的产生。有些炎症介质、细胞因子通过内分泌、旁分泌和自分泌等方式起作用,如产生前列腺素E1、前列腺素E2、白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等,诱导炎症过程发生,产生关节红、肿、热、痛及活动障碍等关节炎症反应。尿酸盐沉淀如逐渐增多,并进一步浸润关节软骨、骨髓、滑膜、肌键及关节周围组织,可导致软骨细胞及骨细胞退变,最终可导致关节的畸形和功能障碍。IL-1β、TNF-α等炎症细胞因子,在痛风性关节炎的发生、发展中起着重要作用。IL-1β是调节炎症的始动因素,TNF-α是炎症细胞因子网链中的第1个细胞因子,能诱导其他细胞因子,包括IL-1、单核细胞刺激因子,而IL-1又能提高TNF-α的活性。各种细胞因子相互结合,相互影响,共同参与痛风性关节炎发生、发展的全过程[8-9]。Chapman P T等在动物实验中证实MSU晶体刺激血液中和关节液中单核细胞及吞噬细胞引起IL-1β的大量释放,认为IL-1β是急性痛风性关节炎的一个炎症介质。痛风性关节炎患者的病情与外周血清中IL-1β浓度变化呈正相关。Manicourt D H等在尿酸钠导致痛风性关节炎的实验模型中检测出TNF-α mRNA的高表达,尿酸钠可直接刺激滑液中单核细胞导致TNF-α的产生,并且TNF-α对IL-1产生起较重要作用。本实验结果分析,清泻浊毒方能够明显降低大鼠关节组织的IL-1β和TNF-α水平,这可能是其改善关节炎症的主要作用机制之一。
       给大鼠连续灌胃清泻浊毒方4d后,踝关节注射尿酸钠,再连续灌胃3d,其病理切片示仅有少量炎性细胞浸润,未见软骨破坏,而模型组软骨破坏明显,炎性细胞浸润。说明清泻浊毒方能够改善尿酸钠造成的急性痛风性关节炎大鼠的关节炎症程度,阻止软骨及软骨下骨质破坏,因此,清泻浊毒法能够治疗临床急性痛风性关节炎,其是否有预防发作的作用需要进一步深入研究。

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